ONTOGENIA LINFOIDE
ONTOGENIA LINFOIDE B Y T
Prof Dr Carlos Ponzinibbio
Introducción
Desde
el reconocimiento de algunas neoplasias malignas desarrolladas a partir del
tejido linfático se ha intentado ordenarlas y clasificarlas, casi
infructuosamente, por más de un siglo. Todos los intentos de clasificación iníciales
se basaron fundamentalmente en el
análisis de la localización de la afectación y la morfología celular de las células comprometidos
en la proliferación , intentando –ingenuamente- referirla a su contraparte
normal.
En
este fenómeno, visto desde hoy con la necesaria distancia científico tecnológica,
se
puede considerar que el mayor obstáculo
consistía en la ignorancia del origen de las células y su estadio de
diferenciación, pues células con morfología similar, pueden ser actualmente reconocidas como pertenecientes
a diferentes sub-poblaciones celulares y/o diferentes estadios de maduración
El
advenimiento tecnológico suficiente para el reconocimiento de estructuras de
superficie y la disección ofrecida por la biología molecular, con más, la
información citogenética, han permitido obtener un ordenamiento más acorde con
el origen de la célula en proliferación neoplásica(1). Mas aún, el avance del
conocimiento en el campo de la inmunología, con el concepto de repertorio antigénico
basado en la diversidad para la respuesta
a múltiples antígenos a partir de la recombinación somática de
segmentos genéticos presentes en las
células germinales, ha permitido implicar a movimientos genéticos fallidos, vbgr:
mutaciones, traslocaciones , y/o expresiones genéticas anormales, en la
patogenia de numerosas neoplasias linfoides(2). La alteración genética hallada de modo más
recurrente consiste en la yuxtaposición de un oncogén normalmente silente, a un gen
transcripcionalmente activo en forma constitutiva, más frecuentemente, el gen que codifica para la
síntesis de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, De este modo el gen
silente - habitualmente un oncogén-, pasa a ser expresado también en forma
constitutiva(3).
En
este punto, se podría especular que las
patologías linfoproliferativas neoplásicas, son, al menos en parte, el precio a
pagar por esta posibilidad de hipervariabilidad para enfrentar una
multiplicidad de antígenos diferentes
Para iniciar la consideración de las
enfermedades linfoproliferativas
neoplásicas, es bueno comenzar por el
principio: el origen de las células del tejido linfático
Las poblaciones linfoides pertenecen al
sistema hemopoyético, de donde resulta que para considerar la ontogenia
linfoide (la
historia del cambio estructural de una unidad sin que ésta pierda su organización)
y sus principales poblaciones, conviene recordar algunos conceptos generales de
la hemopoyesis que a la luz actual parecen hallarse bien establecidos.
Medio siglo de descubrimientos biológicos,
experimentación científica y práctica médica han permitido establecer la doctrina de la Célula Madre Pluripotencial
de la Médula Ósea, como el punto de partida de todas las estirpes celulares hemopoyéticas
en la vida humana adulta normal.
Las células que otorgan el sustrato al
sistema inmune pertenecen al tejido linfático y su origen es el compartido con
todas las células que normalmente pueblan la sangre circulante.
La
mayor parte de estas células, tienen una vida media breve comparada con la
sobrevida del huésped, de donde se requiere de un sistema para la reposición
constante de estas células- aproximadamente un trillón de células diarias-(4). La hemopoyesis – un sistema de renovación
celular por células madre, es la repuesta biológica a la exigencia recurrente
de producir nuevas células diferenciadas. Y la hemopoyesis en la vida postnatal
en el hombre se desarrolla en la médula ósea. Y hasta la información actual, se
puede asentir en el concepto que todas las células del sistema tienen origen en
una única célula madre, dotada de tres atributos básicos: auto renovación, pluripotencialidad,
y capacidad de repoblación de un huésped
ablacionado( Fig. 1).
Básicamente, se debería pensar en el
desarrollo de las células linfoides como un proceso ordenado que se inicia en
una célula única, alojada en nicho confortable y eficaz, sensible a los
estímulos de activación, con potencial suficiente para mantenerse y
diferenciarse, que a partir de la médula
ósea origina en etapas sucesivas, progenitores cada vez más comprometidos con
un linaje particular y que en el estadio de maduración adecuado, emigran de la
médula ósea, para progresar en su diferenciación, sea inicialmente en el bazo (
células B) o en el timo ( células T) ( Fig.
2).
Alcanzado en estos órganos el estadio madurativo apropiado, se encuentran
ya capacitadas para emigrar a los órganos linfoides secundarios periféricos, recircular,
enfrentar el antígeno y desarrollar una adecuada respuesta inmune adaptativa.
Se comprende que para que este proceso tenga lugar normalmente, es necesaria la
expresión de los genes correctos en el momento oportuno. Esta expresión de
genes presentes en la línea germinal, está condicionada por la activación o
represión de factores de transcripción nucleares, cuya expresión es sensible a
la acción de factores de crecimiento apropiados ( Fig. 3).
Todo ello orquestado de un modo admirable para obtener el
máximo de respuesta posible, la menor redundancia, y la eliminación de células
innecesarias.
2.Hemopoyesis medular
La
médula ósea es el asiento normal de la hemopoyesis durante la vida postnatal, y
las Células Madre Pluripotenciales (CMP) se hallan alojadas en sitios
específicos conocidos como nichos. Allí alojadas, interactúan con otras CMP, células de la
estroma y elementos de la matriz extracelular(5).
Si bien,
se atribuía la decisión de la célula a seguir el camino de la autorenovación o
el camino de la diferenciación a una cuestión estocástica, es necesario tener
en cuenta que las células primitivas tienen
genes de múltiples linajes a bajo
nivel y que la modificación de la estructura
de la cromatina puede participar en la decisión modificando la expresión
génica. Una proteína de hallazgo reciente- Polycomb BMI-1- pareciera participar
en el proceso de decisión: la
sobre-expresión de BMI-1 a través de modificaciones
de la cromatina, estimula la autorenovación , mientras que la pérdida de
función de la proteína, induce la diferenciación celular(6) (Fig. 4).
Además de las modificaciones epigenéticas,
o mas bien en conjunto con las mismas, los
elementos del nicho medular en el que se
encuentra alojada la CMP pueden participar en inducir a una decisión para su
futuro.
2.1 Estructura de la Médula Ósea
La
médula ósea es un tejido conectivo
altamente celular que ocupa el espacio medular de la mayor parte de los
huesos del adulto, particularmente los
huesos planos, esternón, ilíacos, vértebras y diáfisis de huesos largos.
En la cavidad medular ingresan arteriolas que se ramifican hasta la formación
de sinusoides que se anastomosan ricamente entre sí. La pared de estos sinusoides está constituída
solamente por una capa única de células
endoteliales frecuentemente recubiertas en su cara externa por las células
adventicias (Fibroblastos).
Prolongaciones de estas células, ricas en fibras de matriz extracelular, laminina, colágeno, fibronectina, se anastomosan para formar la malla de soporte
para las células hemopoyéticas de la médula ósea. Los sinusoides confluyen para conformar venas
para el drenaje de la cavidad medular. Las arteriolas, capilares, sinusoides,
vénulas y venas conforman el compartimiento vascular de la médula ósea.
Interdispersas en la cavidad medular se
encuentran, en cantidad variable las células grasas: los adipocitos. La cara
interna del hueso y las trabéculas óseas están revestidas por el endosteum, que
incluye las células activas sobre la matriz ósea, precursores osteogénicos,
osteoblastos y osteoclastos En conjunto, estos elementos mesenquimáticos constituyen
lo que se denomina estroma medular. El espacio restante, el intersticio en
forma de cordones, es el que ocupan las células hemopoyéticas(7).
2.2 Concepto de microambiente hemopoyético
medular:
Tanto
los trasplantes experimentales en animales, como en humanos, han puesto
claramente en evidencia que las células
hemopoyéticas infundidas se alojan naturalmente en la médula ósea
(homing). Esto se explica porque la médula ósea ofrece a los precursores
hemopoyéticos condiciones únicas y esenciales para su alojamiento. La explicación actual para el concepto de
microambiente medular se basa en las propiedades de las células de la estroma,
que expresan en superficie moléculas de adhesión, secretan factores de
crecimiento necesarios para sostener la proliferación celular, interleuquinas
activas sobre las células y productos de la matriz extracelular construyendo un
andamiaje apropiado para el mantenimiento y proliferación de las células. La
expresión de moléculas de adhesión facilita el anclaje de las células por unión
homo o heterotípica a otras células o a la matriz extracelular. Los progenitores hemopoyéticos expresan las integrinas de la familia b1: a2b1, a6b1,
a4b1, y
a5b1. Estas dos últimas integrinas se unen a la
fibronectina de la matriz extracelular favoreciendo la quiescencia celular de
los progenitores, mientras que la integrina a4b1
se une a la molécula VCAM-1 expresada en las células endoteliales y fibroblastos.
Con la progresión en la diferenciación de los progenitores, disminuye la
intensidad de la unión entre moléculas, mientras que la expresión de moléculas
también se halla determinada por el nivel local de factores de crecimiento,
regulando de este modo el estado de las células progenitoras. Por el contrario, la familia de las integrinas
b2, pareciera estar asociada a la emigración de las células de la médula
ósea. La principal de entre ellas, LFA-1 se expresa débilmente en los
progenitores, pero su expresión aumenta con la diferenciación celular y es máxima en los leucocitos maduros. La
molécula CD43 (sialomucinas) se
encuentra abundantemente expresada en casi todas las células hemopoyéticas y
reconoce como ligando entre células a ICAM-1. La activación de CD43 señaliza a
través de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y el impacto de su
activación sobre las células depende del estadio de diferenciación en que se
halle, estimulando la adhesión a través de integrinas de la familia b1
en los progenitores pero no en las células madre. La señalización a través de la molécula CD34, (glicoproteína
del tipo sialomucina) antagoniza la maduración de células hemopoyéticas. La
expresión de CD34 en células endoteliales, le ofrece una oportunidad de
adhesión homotípica a los progenitores hemopoyéticos al endotelio medular. La
tercera sialomucina de importancia en el microambiente medular es la molécula
CD164, expresada en precursores hemopoyéticos y en células del sistema monocito-macrófago
y precursores eritroides, actuaría como un regulador negativo de la hemopoyesis
a nivel de la proliferación celular(8).
Las
selectinas, participan en el anclaje de células hemopoyéticas precursoras. En
los progenitores hemopoyéticos la proteína
ligando 1 de P selectina (PSGL-1) interviene
en la adhesión a P-selectina expresada en células endoteliales. Esta unión
también actúa como factor regulador negativo de la proliferación celular.
El
papel de ICAM-1en el nicho hemopoyético estaría dado por la unión homotípica
entre células progenitoras que la expresan, o heterotípica, con proteínas de la matriz extracelular. La
unión del ligando a esta molécula, desencadena hacia adentro de la célula una
señal de activación que utiliza quinasas de mitógenos y fosforila proteínas de
la familia Src la que tiene como
blanco de activación al factor de transcripción nuclear AP-1, de
relevancia en la regulación de la diferenciación
y activación celular. VCAM-1, se expresa abundantemente en la estroma medular y
desarrolla un papel importante en la localización de progenitores hemopoyéticos
durante la embriogénesis. En la vida adulta, utiliza como ligando a la integrina a4b1 para
retener los progenitores hemopoyéticos en el nicho medular
Los
elementos de la matriz extracelular de la estroma medular también desempeñan un papel
relevante en la formación del microambiente hemopoyético. El hialuronato, es el
ligando primario para la molécula CD44 expresada en progenitores hemopoyéticos
cuya unión resulta de suma importancia
para la proliferación mielopoyética y linfopoyética.
En
conjunto todos estos elementos son los que le ofrecerían a los precursores hemopoyéticos las
condiciones de habitabilidad necesaria para su permanencia, básicamente en
situación de reposo -G0-, pero
con suficiente sensibilidad para permitir la estimulación a la
proliferación de las células hemopoyéticas(9).
2.3 Concepto de pluripotencialidad
El
concepto de pluripotencialidad es inherente al concepto de célula madre única.
Para que todos los tipos celulares tengan origen en una célula, ésta necesita
la capacidad de seguir todas las vías de diferenciación posible.
La
construcción de una imagen en abanico como expresión simplificada de la
hemopoyesis, debe comprenderse como una
sobre-simplificación esquemática que el
armamentario bio-tecnológico actualmente
disponible se está encargando de cuestionar en profundidad(10).
Si
bien el esquema del abanico clásico, mostraba el pasaje de un estadio precursor
al siguiente, a la luz actual, parece improbable que esto ocurra tan sólo en un
paso mitótico único. Es posible que el compromiso de linaje sea la expresión de una secuencia de pasos de
restricción progresiva en mitosis sucesivas(11).
El concepto de pluripotencialidad va
necesariamente ligado a la idea del compromiso ulterior con un linaje o estirpe
celular determinado. Este hecho implica entonces la restricción progresiva de
posibilidades o alternativas de vías de
diferenciación celular por medio del
silenciamiento genético, hasta alcanzar el compromiso definitivo con un único
linaje por expresión de los genes apropiados y completar la diferenciación celular.
En los
trabajos de trasplante y retrasplante se ha postulado la presencia de dos tipos
de precursores muy tempranos. Aquellas células –LT-HSC- ( Thy1.1lo,
Flt-3-, Lin-, Sca-1+, c-KIT+, o
bien CD 34-, Flt-3-, LSK) capaces de mantener la
hemopoyesis a largo plazo; y otras células –ST-HSC- ( Thy-1.1lo, Flt-3+ LSK,
o CD34+, Flt-3- LSK) capaces de sostener transitoriamente, alrededor
de seis semanas, la hemopoyesis en el
huésped trasplantado. Si bien estas células tienen un potencial multilinaje,
tienen una capacidad de proliferación acotada y pierden su habilidad de auto
renovación. La secuencia ontogénica sería: LT-HSC > ST-HSC > MPP (12).
3. Ontogenia linfoide
Se ha
postulado una división inicial a partir de la Célula Madre Pluripotencial, en
dos precursores básicos, uno comprometido con el linaje mielopoyético y otro
comprometido con el linaje linfopoyético. En esta primera hipótesis, el
reconocimiento fenotípico de la restricción en sentido linfoide pasaría fundamentalmente por la expresión del
receptor de IL-7, la primera molécula indiscutiblemente asociada a la diferenciación
linfoide pues la expresión del receptor c-kit es compartido con precursores
anteriores comunes. Alternativamente, varios estudios han puesto en evidencia
la existencia en médula ósea del adulto de un precursor compartido, con
potencial de generación de células linfoides B/T y granulocítico- macrofágica,
sin potencial megacariocítico(13). Algunas leucemias bifenotípicas M/T o M/B
concurren en apoyar esta hipótesis pues no se encuentran leucemias mixtas B/Mk
o T/Mk. Mas aún, dentro del
compartimiento de progenitores multipotenciales Lin-, SCA-1+, c-Kit+, se ha
demostrado el potencial combinado B, T y GM. Estas células llamadas Precursores
multipotenciales con imprimación
linfoide ( lymphoid-primed) expresan el receptor para Flt-3 en superficie, y en ellas la expresión transcripcional de
varios genes linfoides (Rag-1, IL-7Ra) podría
anteceder a la aparición de la célula
llamada Precursor Linfoide Comun (CLP)(14). El CLP necesita de los factores Ikaros y Gfi-1, mientras
disminuye el potencial de diferenciación mieloide mediada por la represión del
factor de transcripción E2A , sugiriendo que este factor sería necesario para
el mantenimiento de células madre de mayor potencial(15). Para la acción
adecuada de los factores de transcripción se hace necesaria la accesibilidad de la cromatina a los genes
blanco. Esta accesibilidad a la cromatina se cerraría con la diferenciación o
compromiso linfoide . En concordancia con este concepto, se ha observado que el
remodelador de cromatina Mi-2b puede interactuar con el factor Ikaros
y restringir la salida de células del
pool de células madre, manteniéndolas con una firma genética determinada. Si
falta la molécula Mi-2b se
desarrolla un impulso al compromiso con la transcripción de genes de compromiso
de linaje como Rag-1 y b-globina(6). Se ha propuesto entonces
que la diferenciación en sentido
linfoide requeriría de modificaciones en
la estructura cromatínica que
facilitaría la imprimación linfoide en células tempranas que aún tienen
potencial también mieloide . El paso crítico para el pasaje de la célula
precursora común linfoide- mieloide
estaría dado por la alteración de la expresión de genes, con de-regulación
de los genes Mk/E ( Gata-1, Gata-2, Mpl,
Scl/Gf1b) y la expresión de genes linfoides (Dntt, Rag-1, e IL-7R) y la
expresión en superficie de Flt3, para lo que es necesaria la activación del
factor Ikaros. Este CPL se define
por la necesaria expresión del receptor para IL-7 , promovida por la activación
del factor de transcripción PU.1, con más: Thy-1.1- Lin-, SCA-1lo y
c-Kitlo. En él, ya comienza a asomarse la expresión del factor EBF-1
que es un factor de transcripción esencial para la diferenciación de células B,
mientras que Pax-5 casi no se halla aún expresado, hecho consistente con la
posibilidad de este precursor para el desarrollo de células T y NK . No
obstante, en la médula ósea , la activación del represor transcripcional LRF,
que previene la activación de la vía de señalización Notch ( necesaria para la
diferenciación linfoide T) impediría la
progresión intramedular a la diferenciación T. La existencia de este precursor
comprometido con el linaje linfoide pareciera indicar el origen común de todas
las poblaciones linfoides: B, T y NK(16).
De este modo, el primer paso en la restricción
de linaje no sería la separación entre precursores comprometidos con la estirpe
mieloide y la estirpe linfoide, sino que, a partir del precursor
multipotencial, se separaría en primera instancia un precursor megacariocítico-eritroide
y que esta restricción sería la condición para la continuación de un precursor
común GM-linfoide. Así, la restricción linfoide procedería en dos pasos,
primero la pérdida del potencial Meg/ E, y segundo, la pérdida de GM hasta el
compromiso linfoide definitivo(10,13)(Fig. 5).
La
justificación de la necesidad de provisión continua desde la médula ósea de
células para poblar el timo estaría dada
en primera instancia, por la incapacidad para autoreplicarse de los
timocitos inmaduros(17), lo que parece indicar que existe realmente esta necesidad y estas células serían progenitores
bipotenciales B/T, aunque algunos experimentos apunten hacia un precursor mas
temprano, pues es posible inducir la formación de células B, NK y macrófagos a
partir de precursores tímicos tempranos.
3.1Ontogenia B en la médula Osea.
Para el adecuado compromiso y diferenciación
del linaje B se requiere en la MO de nichos específicos para las células B en
células estromales CXCL-12+, SDF-1ª+ que expresan IL-7, para alojar células
pre-pro B(18) y de la actividad de un
conjunto de factores de transcripción nuclear que intervienen en la regulación
de la expresión genética. Entre ellos se encuentran se encuentran en un punto
central los factores PU.1, EBF1 y Pax-5. Para la transcripción
adecuada del gen Ebf1 se requiere de una
señalización por vía Stat 5 dependiente de EBF1 e IL-7R. La molécula Pax-5 es el blanco de acción
del factor EBF1, y es a su vez ,
responsable de la expresión en superficie de CD19 . La proteína EBF1 colabora
con E2A, Pax-5 y otros factores de
transcripción como Sox-4 y Bcl-11a para
activar genes propios de células linfoides B. A su vez, Pax-5 actuaría como
agente estabilizador de la expresión de EBF1. El conjunto de experimentos
parecería poner en evidencia que la expresión de varios factores de
transcripción actuaría de forma coordinada para promover el compromiso linfoide
y reprimir la expresión de genes de
linajes alternativos(19,20)(Fig. 6).
3.2 Recombinación genética para el receptor de células B
Discutido ya el origen del CLP, la
restricción en sentido B continúa hacia la célula pre-proB, que es el
progenitor B restringido más temprano conocido. Estas células se identifican
fenotípicamente, por la expresión de CD19 + (regula la transducción
intracelular por amplificación de Src) y CD10+, mientras que a nivel genético
expresan los genes RAG-1 y RAG-2, -descubiertos
por David Baltimorecuya expresión
promueve la recombinación de
cadenas pesadas de los genes de inmunoglobuilinas ( Igs) por deleción del ADN
entre el segmento genético D y el segmento J-(21). La proteína RAG-1 es
esencial para la acción de recombinasa VDJ y es
un dímero que corta y une las
hebras de ADN. Siguiendo a la recombinación DJ, se une al segmento
recombinado uno de los genes V para originar el gen reordenado VDJ. Este
reordenamiento constituye un marcador genético de estirpe B. Los genes RAG se
expresan sólo en las células linfoides B y T y en estadios tempranos de la
diferenciación, preferentemente en células en G0. A la diversidad
resultante de la recombinación de los diversos segmentos VDJ, debe agregarse la
diversidad potencial añadida por los nucleótidos P y N. La adición
complementaria de nucleótidos N, para compensar el largo de cadenas dependiente
del sitio de escisión del ADN, depende de la enzima TdT. El máximo de variabilidad está dado por la
unión de los sitios de unión de los segmentos V y C, dando lugar a la región
hipervariable designada como CDR 3, la más importante al momento del
reconocimiento del antígeno. Esta región hipervariable es un buen marcador de
clonalidad para reconocer una enfermedad linfoproliferativa neoplásica.
El
linfocito pre-B, es el primer estadio
madurativo en el que se sintetiza en forma detectable un producto de los genes de las Igs, la cadena m, aunque esta no alcanza la superficie celular y debe ser buscada en el
citoplasma de la célula. Para la síntesis de esta proteína se necesita de la
producción de ARN maduro y funcional
hecho que requiere del corte y
empalme de las secuencias entre los genes VDJ y el gen Cm. En algunas células es posible hallar una
expresión débil del receptor en la superficie celular por la unión de cadenas
pesadas m a unas cadenas sucedáneas de las cadenas
livianas de la Igs que se expresan transitoriamente. Estos receptores se llaman
receptores de células pre-B ( pre-RBC), y su estimulación aparece como
necesaria para continuar la maduración de las células B. Si bien no se ha
identificado al ligando apropiado para esta estructura, estudios recientes
parecieran poner en evidencia que la oligomerización de estos productos sería suficiente para
desencadenar la señal estimulatoria. El pre-RBC juega un papel importante en el
proceso de exclusión alélica durante la hipermutación somática. Esto lo
hace inhibiendo el reordenamiento del
locus genético de la otra cadena pesada del alelo en el otro cromosoma, de modo
que en cualquier clon linfocitario, sólo es posible la expresión de un solo
alelo pues el otro queda expresando el ordenamiento germinal o un
reordenamiento aberrante. En el caso que la célula no alcance a desarrollar un
reordenamiento adecuado en ninguno de los dos alelos, la célula muere por
apoptosis.
En la
siguiente etapa de la diferenciación B – los linfocitos B inmaduros- las
células linfoides reordenan las cadenas livianas, k o l, una de las cuales se asocia a la cadena pesada m ya sintetizada, para formar la molécula completa de IgM . En este caso de reordenamiento de cadenas livianas , al no haber segmentos D en
los locus genéticos, el reordenamiento se produce sólo a nivel VJ, mientras que
el segmento C queda separado por un intron
y la separación se mantiene en el ARN transcripto primario. A este nivel
se produce el corte seguido de empalme del segmento VJ con el segmento C para
formar la cadena liviana k o l que
corresponda. También el reordenamiento de las cadenas livianas se ve
influenciado por la presencia del pre-RCB, haciendo que su participación
adquiera relevancia para alcanzar la síntesis completa del receptor (Ig). Existe
un orden para el reordenamiento de las cadenas livianas, primero k y luego l, con un efecto inhibitorio entre ellas, vale
decir que la cadena l solo se logra si falla el reordenamiento
para la cadena k. Este hecho determina que el clon
linfocitario exprese solamente una de las cadenas livianas (22). También en
este caso, si la célula falla en reordenar adecuadamente alguna de las dos
cadenas livianas muere por apoptosis .
Al final de su maduración estas células expresan en superficie la molécula del
receptor completa, una molécula de IgM.
Este receptor puede reconocer antígenos pero es incapaz por sí mismo de inducir la proliferación celular. Es más,
si reconoce un antígeno propio presente en la MO, lleva a la célula a morir por apoptosis. Este
es un paso importante en el proceso conocido como deleción de clones
autoreactivos o selección
negativa.
Una vez que la célula linfoide B ha sido
capaz de reordenarse adecuadamente para la síntesis productiva del receptor IgM, se considera un linfocito inmaduro capaz
de emigrar de la médula ósea hacia los órganos linfoides periféricos a través
de la circulación sistémica(23)(Fig.
7).
3.3 Diferenciación linfoide
B post-medular
Al bazo, las cèlulas B inmaduras, llegan por medio de las arteriolas que se
encuentran bordeadas por un manguito o vaina periarteriolar constituido en
mayoría por células linfoides T(23). Bajo su influencia, la célula B inmadura
progresa hacia un estadio de maduración
intermedio o transicional. En esta localización maduran hacia la forma conocida
como células T2B, estadio en el que son
capaces de proliferar por la estimulación con el factor de crecimiento B (
BAAF) producido por el microambiente esplénico(Fig. 8).
Este proceso de selección positiva está al menos en parte
regido por antígenos propios del huésped originados en la sangre circulante . Por ello,
tan sólo una pequeña proporción de células B progresa hacia la célula B madura naife
o virgen. Cuando la célula B alcanza esta condición, se encuentra habilitada para
recircular reiteradamente y también alojarse en la misma médula ósea, en forma de
acúmulos discretos perisinusoidales, y en otros órganos linfoides secundarios:
ganglios, amígadalas, MALT(25,26).
Allí se quedan hasta el encuentro definitivo con
el antígeno que les otorgue sentido a su existencia Al final de la secuencia de
maduración , tres tipos posibles de células B son engendradas: células B
foliculares, células B de la zona
marginal y células B-1 B(21).
3.3.1 Cèlulas
B foliculares
Las
células B foliculares, encuentran su
alojamiento preferencial en el centro folicular de los ganglios linfáticos, las
placas de Peyer y el bazo(27,28). Al llegar allí, las células B vírgenes quedan
ubicadas en la zona del manto folicular
hasta el encuentro antigénico. La activación de las células B por
antígenos T dependientes, requiere además de la unión del BCR , de señales co-estimuladoras
adicionales, provista por la unión del
ligando a las moléculas CD40 y CD28 (29) .
Cuando
el encuentro antigénico se lleva a cabo,
la célula B continúa su progresión hacia el centro folicular, adquiriendo
una morfología mas inmadura ( centroblastos). En el centro folicular-
convertido entonces en un Centro Germinativo- , las células B estimuladas intentan reordenar su receptor para una unión
de alta afinidad con el antígeno, proceso que constituye la hipermutación somática. La recombinación para
cambio de isotipo de inmunoglobulina ( switch)
y la hipermutación somática están mediadas por una enzima denominada
citosina-deaminasa inducida por activación (AID) que se expresa en los centros
germinativos. Si el reordenamiento resultó exitoso la célula B se encuentra habilitada para continuar dos
caminos posibles(Fig. 9),
convertirse
en una célula B de memoria, o, alternativamente, convertirse en una célula
secretoria del receptor recombinado: células plasmática de larga sobrevida
dependiendo, al menos en parte, de la acción del Blimp-1; capaces de migrar a
la médula ósea y sostenerse en la misma(30,31).
Para
la formación de los Centros Germinativos (CG) donde el ritmo de proliferación
celular es elevado (expresado por el marcador Ki67) en los folículos primarios
de los ganglios linfáticos se requiere de la expresión de la proteína Bcl-6, la
que promueve la proliferación celular e inhibe su diferenciación. Para lograr
este efecto en las células B, se necesita de la acción de los
co-factores N-cor, SMRT o B-Cor, los que forman en conjunto un mecanismo represor de genes tal como ATR y
CDKN1A que sólo se activa coincidiendo con la activación de CD40 y actúan a través de la vía del factor de
transcripción NFkB(Fig.
10).
La acción promotora de la formación de centroblastos de la proteína Bcl-6,
se evidencia por su elevada expresión en linfomas de grandes células centro
foliculares, en los que las células que
los forman quedan congeladas en ese
estadio de diferenciación.
En el
centro folicular se diferencian dos tipos de células, ubicadas en zonas
geográficamente distinguibles, los centroblastos en la región oscura
centrofolicular y los centrocitos, ubicados en la región clara centrofolicular.
Si bien, estudios recientes ponen en evidencia que la proliferación celular
tendría lugar en ambos tipos de poblaciones celulares, y estaría vinculada a la
estimulación por el antígeno, la
proliferación celular estaría gobernada por señales diferentes. En la zona
oscura, donde las células no se asocian a células dendríticas sería suficiente
la estimulación del BCR para activar la proliferación celular, mientras que
para una estimulación más amplia se necesitaría la co-estimulación de CD19 en
las células vinculadas a las células dendríticas centrofoliculares. La
expresión de quemoquinas es diferente en estos dos tipos celulares, los
centroblastos expresan CXCR4 mientras que los centrocitos expresan CXCR5 y se
encuentran asociados a las células dendríticas que retienen antígenos. Posiblemente
serían estas células, que, estimuladas por el antígeno y células T centrogerminativas,
luego de la hipermutación somática y del
cambio de isotipo , darían origen a las
células B de memoria de larga vida y las
células plasmáticas(32). La elección entre estas dos posibilidades estaría dada
por la acción de diferentes factores de transcripción y vías de señalización
celular. Es interesante señalar que en estudios microscópicos dinámicos en
tiempo real se ha observado una notable
movilidad de las células centrogerminativas entre ambas zonas, oscura y clara,
sugiriendo que para el armado de una adecuada respuesta al antígeno fueran
necesarias varias vueltas de contacto con células T para alcanzar una correcta hipermutación
somática(33).
3.3.1.1
Diferenciación a células plasmáticas
Para
la progresión desde células B centrofoliculares a células plasmáticas se
requiere la represión de Bcl-6 y la expresión de Blimp-1 por señalización de la
vía de transducción STAT3. La proteína Bcl-6 se fosforila por MAPK activada por
la unión de ligandos al BCR, se reprime y degrada. A esta vía le acompaña
la inhibición promovida por el factor IRF4, inducida por NFkB siguiendo a la estimulación del CD40. En esta forma, Bcl-6 y Blimp-1
cumplen papeles antagónicos en el CG, y Blimp-1 extingue la acción de Bcl-6 y
Pax-5 haciendo perder a la célula B el fenotipo centroblástico e iniciando la diferenciación hacia célula
plasmática. Cooperando con esta vía se halla IL-21, que estimula la célula B por
medio de STAT3 y STAT5(Fig. 11) .
Antes de la diferenciación completa a célula plasmática, la célula B pasaría
por un estadio de diferenciación intermedio, el plasmoblasto, que expresa altos
niveles de moléculas del CMH y es aún capaz
de migrar y de replicar mientras que la célula plasmática madura ya
perdió su potencial proliferativo. Los plasmoblastos expresan los receptores de quemoquinas CXCR3 y CXCR4 ,
lo que les permite migrar a la médula ósea y a los sitios de inflamación (34).
El paso más importante en la transición del estadio de plasmoblasto a célula
plasmática está dado por la inmovilización definitiva de la célula, hecho que
le permite completar el armado de su maquinaria secretoria de anticuerpos y
vivir por un largo tiempo. Estas células
constituyen las células secretorias de memoria prolongada. La sobrevida de las
células plasmáticas en la medula ósea depende de un conjunto de moléculas,
particularmente BCMA, April, BAFF, IL-6 y su receptor y la interacción de
quemoquinas, CXCR4 y su ligando CXCL12. Se sugiere que la localización de las
células plasmáticas, tanto en el bazo como en la médula ósea, se realizaría
también en nichos específicos, donde las células estromales expresan alto
contenido de CXCL12 y VCAM-1(35). Blimp-1 es el mas importante factor determinante
de la diferenciación y sobrevida de las células plasmáticas, y su actividad
permite la expresión del gen Xbp-1 que induce la respuesta de desplegado de las
inmunoglobulinas. Sin una adecuada respuesta de desplegado de Igs estas no
podrían secretarse adecuadamente a partir del aparato de Golgi(Fig. 12).
Las drogas que inhiben los
proteasomas, -útiles en el mieloma-dañan este mecanismo y conducen la célula a
la apoptosis Las células plasmáticas diferenciadas, continúan la secreción de
su receptor en forma constitutiva por un período prolongado de tiempo y su
longevidad se asegura por la expresión
de genes antiapoptóticos tales como bcl-2 y mcl-1.
3.3.1.2
Diferenciación a células B de memoria
Para la diferenciación hacia células B de memoria ocurre le represión de
los factores que promueven la diferenciación plasmocítica mientras se
expresan PAX-5 y el factor de
transcripción asociado a la microftalmia
( MITF-1). Estas células B de memoria juegan un papel crítico al momento de
enfrentar patógenos frecuentes con el rápido armado de una respuesta inmune
secundaria en poco tiempo, estimulando la producción rápida de anticuerpos
específicos por la hipermutación somática pre-existente , aunque sólo
aproximadamente la mitad de ellas hayan realizado el cambio de isotipo Ig M
> IgD. Para la sobrevida de las
células de memoria no se necesita de la presencia del antígeno, pero si es
crucial la presencia del BCR tanto en ellas como en las células B vírgenes
Si
bien algunas células de memoria se
encuentran recirculando, el depósito mayor de células B de memoria se encuentra
en la zona marginal esplénica y en las localizaciones intra o subepiteliales. Además
de expresar CD 27, las células B de memoria, expresan CD 19+, CD220+, CD21+, CD24+, CD25+ y CD38+(Fig.
13).
No existiría una única población de células B de memoria, pues se puede
hallar un fenotipo similar en células B CD27 negativas(36). Además de la
formación de células B de memoria en el centro germinal, en presencia del
antígeno y la co-estimulación por células T, también podrían formarse células B
de memoria en la población de células capaces de armar una respuesta inmune
timo- independiente (TI), particularmente de la zona marginal , aunque estas
células serían de vida media más cortas que las células B de memoria clásicas, pero aún eficaces en la defensa frente a gérmenes
capsulados(37).
3.3.2 Células B de la Zona Marginal
Las
células B de la zona marginal, expresan en superficie un nivel alto de CD21+ (
receptor para la fracción C3 del complemento), lo que les serviría para
reconocer con facilidad complejos inmunes. Son capaces de reconocer antígenos T
independientes y originar células plasmáticas de sobrevida corta, aún si la
unión del BCR en respuesta a antígenos de microorganismos circulantes en la
sangre, y la estimulación producida,
reduce la expresión de integrinas permitiendo la migración de la célula,
hacia la pulpa roja en el bazo . En los ganglios linfáticos humanos presentan
un fenotipo de células IgM+ de memoria y se hallan en la zona marginal
periférica al centro folicular. Para la
retención de las células B en la zona marginal participan las uniones de
moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1
expresadas en las células estromales, con las integrinas LFA-1 y a4b1 expresadas en las células linfoides . Particularmente, en la zona
marginal, desarrolla un papel relevante el equilibrio entre esfingosin-1-fosfato ( SIP-1) y la quemoquina CXCL13. Dada la abundante expresión de moléculas
clase II del CMH, de B1 y de B7, estas
células de la zona marginal, se encuentran bien equipadas para actuar también
como células presentadoras de antígenos T-dependientes e interactuar con las células
T para el armado de una respuesta inmune adptativa
3.3.3 Células B B-1
Existiría una población diferente de células
B, llamadas células B 1, de origen hepático fetal, a la que se le atribuye la
separación desde un estadio anterior del precursor linfoide común de la vida adulta.
Estas células tiene varias características que permiten distinguirlas: secretan anticuerpos IgM contra antígenos carbohidrtaos naturales múltiples, presentan
escasa IgD de superficie, son CD11b+ y CD5+, y se encuentran
preferencialmente en la zona marginal del bazo
y serosas
3.4 Diferenciación de células T
Queda
actualmente claro que es necesaria la repoblación continua del timo con
precursores provenientes de la médula ósea para generar timocitos maduros y que las quemoquinas SDF-1a, CCL 19, CCL 21, y CCL 25
parecen jugar un papel dominante para dirigir el alojamiento linfocitario. La
célula de origen pareciera ser una célula en un estadio anterior al CPL
pues, los llamados precursores timocíticos
tempranos, retienen aún cierto potencial de diferenciación macrofágica. No
obstante, han perdido la capacidad de diferenciación B. Para el inicio de la
diferenciación T, se hace necesaria la acción del factor de transcripción E2A y
la vía de señalización Notch que es, de alguna manera regulada por el mismo
factor E2A(38). Cuando las células
ingresan en el camino d diferenciación T guiadas por la acción de la vía Notch,
se expresan otros genes necesarios para la progresión en la diferenciación,
tales como: TCF1, LEF1 y Gata-3. En los
estadios iniciales de la diferenciación T las células retienen cierto potencial
de diferenciación NK, y se hace necesaria la represión del factor PU.1 para
continuar la diferenciación hacia formas
completamente comprometidas con la línea T(39).
La primera fase de estas células comprometidas es llamada pro-linfocito
T. En la línea germinal de estas células se encuentran los genes necesarios
para la codificación de receptor de células T (TLR), pero estas células no lo
expresan en superficie, como tampoco expresan CD3. Su ubicación es en la
corteza del timo, y como no expresan ni CD4 ni CD8 se les llama doble negativos.
Para el reordenamiento de los genes del TCR se hace necesaria la expresión
anterior de los genes Rag -1 y Rag-2. El paso inicial del reordenamiento es a
nivel de la cadena b del TLR y para el mismo se une un segmento D
(cualquiera de los dos D) a un segmento
J (cualquiera de los dos J). Cuando se produce el reordenamiento inicial, las
células pasan a considerarse como pre-linfocitos T. Los segmentos VDJ se unen a
un segmento C para transcribir un ARN maduro que ordena la síntesis de la
proteína Cb completa. Ante un reordenamiento productivo
de cadena b, esta se expresa en la superficie de la
célula unida a una proteína invariable llamada pre-Ta , al CD3 y a la cadena z. Esta es la configuración del receptor del
linfocito pre-T. Este receptor del linfocito pre-T es necesario para regular la
proliferación y sobrevida de las células T en diferenciación, dirigiendo la recombinación
en los genes para las cadenas a y el pasaje al estadio de linfocitos doble
positivos, inhibiendo la accesibilidad a los genes de cadenas b del otro alelo ( exclusión alélica). Completado este paso, los linfocitos expresan en superficie tanto
CD4+ como CD8+ pasando a denominarse
doble positivos . La doble positividad induce la expresión de la quemoquina
CCR7 que determina el camino de estas células desde la corteza a la médula
tímica. En este pasaje, la re-expresión de los genes Rag-1 y Rag-2 contribuye
al reordenamiento de las cadenas a por la
unión de los segmento V y J. Dado que hay un alto número de segmentos Ja en los genes de las cadenas a, la
posibilidad de producción de un receptor
ab funcional es elevada, en caso contrario, si
la célula no logró un reordenamiento adecuado, muere por apoptosis. La progresión
exitosa en la diferenciación, conduce finalmente a la expresión de un TLR
completo(Fig.14),
Que además de las
cadenas a y b, se
asocia a la molécula CD3 y a la cadena z. La
conformación de este complejo inhibe la expresión de los genes d y g, por lo que estas células excluyen la
posibilidad de un TLRgd. Estos linfocitos con un TLR ab
completo ya se hacen reactivos a los antígenos y la restricción determinada por
el CMH a través de los timoproteasomas concluye en una célula CD4+ o CD8+ (timocitos positivos
simples)(40).
Para
comprender la fase final de la maduración linfoide T se hace necesario tener en
cuenta que las células T son funcionalmente útiles cuando el antígeno le es
presentado en el contexto de moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH). Cabe recordar que se diferencian en estas moléculas
las de Clase I, pertinentes a la respuesta efectora y las de Clase II, que
participan en la presentación antigénica de la rama aferente de la respuesta
inmune. La diferenciación de las células doble positivas transcurre por el
carril de la selección positiva primero y la selección negativa después.
En
este proceso de selección clonal es central la intensidad de la afinidad en la
unión del ligando- antígeno- al TLR. La avidez de la unión es un factor
decisivo para el futuro de la célula, tanto como para decidir entre la vida y
la muerte de la misma
Para
la selección positiva, se hace necesario que la célula T que expresa el TLRab
reconozca algún antígeno propio en la
corteza del propio timo en una situación de baja afinidad por el mismo. En este
caso, si la unión se hace en el contexto de moléculas clase I del CMH, la
diferenciación linfocítica se hace hacia el linfocito CD8+. Si en cambio, el
reconocimiento antígénico se realiza en el contexto de moléculas de clase II ,
la diferenciación lleva al linfocito CD4+. Ahora bien, si no se encuentra ningún
antígeno con la célula doble positiva capaz de unirse con algún grado de
afinidad, se activa el mecanismo endógenos de la apoptosis que termina con la
vida de la célula.
En la
selección negativa, la determinante principal está dada por la unión con alta
afinidad del antígenos a al TLR, siempre en el contexto del CMH. Cuando esto
ocurre, como es con antígenos propios expresado en células dendríticas del
timo, la activación intensa precoz del TLR conduce a la célula a la muerte por
apoptosis. Este fenómeno puede ocurrir tanto en la cortical del timo con
células doble positivas , como en la medular con células simples. Las células
medulares tímicas expresan una
proteína denominada AIRE(41), por
regulador de la autoinmunidad, que participa en el proceso de selección
induciendo la expresión de algunos genes específicos de tejido. Este proceso de
selección negativa es la vía de deleción de los clones autoreactivos y constituye la base de la llamada tolerancia
central. La falla de este proceso, así
como mutaciones de la proteína AIRE pueden conducir al desarrollo de
enfermedades autoinmunes.
3.4.1Linfocitos T CD 4
Esta
subpoblación de linfocitos definida por la expresión en superficie de la
molécula CD4+ y capaz de reconocer antígenos
en el contexto de moléculas clase II del CMH se conoció inicialmente como una
única subpoblación capaz de colaborar ( helper) con las células
B y macrófagos en el armado de una
respuesta inmune eficiente(42). A partir
de 1986, gracias a los cultivos prolongados de Mossman y cols, se vio que
existía una primera subdivisión en dos poblaciones más, caracterizadas por el
patrón de citoquinas capaces de sintetizar. En una predominaba la síntesis de
Interferon-g e IL-2 y en la otra, la síntesis de IL-4.
Estudios subsiguientes en ratones concluyeron en distinguir estas
subpoblaciones de linfocitos T CD4+, llamadas Th1 y Th2 y se observó que la
primera predominaba en las respuesta inmune adpatativa celular, y la segunda en
la respuesta inmune mediada por anticuerpos, particularmente frente a helmintos
y microorganismos extracelulares en condiciones normales. También se reconoce
la participación patogénica de estas dos
subpoblaciones en procesos de activación patológica, la población Th1 participa
en la patogenia de enfermedades autoinmunes, mientras que la población Th2
predomina en los procesos atópicos. Para la diferenciación de células T hacia
la vía Th1 se hace necesaria la expresión del factor de transcripción Tbet,
mientras que la vía STAT-1 constituye la principal vía de señalización para la
síntesis de IFNg , siendo este interferon el inductor de la
expresión del factor de transcripción
conformando un anillo de retroalimentación positiva . Para la diferenciación de las células T hacia
la vía Th2 es necesaria la expresión del
gen GATA-3 estimulada por la activación de la vía de señalización STAT-6, la
cual es utilizada normalmente por la IL-4. Para aumentar aún más la complejidad de la
diferenciación linfoide T CD4+ , se ha reconocido más recientemente, que algunas
de las funciones atribuidas a la población Th1 en realidad pertenecen a otra
subpoblación T CD4+, llamada Th17 que no expresa los patrones de citoquinas de
Th1 ni Th2, mientras que expresan IL-21(43).
Para alcanzar esta diferenciación se requiere de la activación del factor
transcripcional RORgt y de
la vía de señalización STAT-3 Otra
subpoblación de células CD4+, CD25+, IL-2R+, cumple una función reguladora a través de la
síntesis de moléculas encargadas de apagar los procesos inflamatorios y la
respuesta inmune como TGFb e
IL-10. Esta subpoblación es reconocida actualmente como células Treg
(44). Estas células son capaces de sintetizar también IL-27 e IL-12p35
contribuyentes también a la actividad supresora y necesitan de la expresión de Foxp3 para su
diferenciación(45).
3.4.2Linfocitos gd:
Esta
subpoblación de linfocitos T constituye un linaje específico originado en el
precursor común CPL. Se diferencian por las cadenas del TLR y parecieran constituir
un resabio en la vida adulta de la linfogénesis fetal. En este período
predominan las recombinaciones de los genes g y d, con un grado mayor de libertad que los genes de las cadenas ab. La integración por el conjunto gd es
excluyente de la recombinación con cadenas ab y
viceversa, de modo que las células pueden expresar sólo un tipo de receptor. Es probable, que los
escasos linfocitos que reordenan con cadenas gd en su TLR presenten una afinidad por unos pocos gérmenes a través de la
expresión de receptores Toll, que se localizan preferentemente en las barreras epiteliales(46).
Los linfocitos maduros, que han aprobado
satisfactoriamente los procesos de selección positiva y negativa, y que
expresan alternativamente CD4+ o CD8+ se hallan listos para salir a participar
en el juego de la respuesta inmune adaptativa. Emigran del timo y se localizan
en regiones específicas de los órganos linfoides periféricos secundarios y en
áreas subepiteliales. En el bazo, lo hacen en la vaina periarteriolar ,
mientras que en los ganglios linfáticos, se localizan en la región
paracortical. Además de la localización en sitios estratégicos para conformar
la defensa, una parte significativa de la población T madura se halla en
recirculación continua, proveyendo así, en beneficio del huésped, a la
posibilidad de armar con un repertorio limitado de receptores, una respuesta inmune adaptativa frente a un gran número de antígenos posibles.
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